TS SOI: Біоактивні характеристики поверхні, яка покрита буферним агентом рН (дослідження in vitro)

/Автори: Хьончуль Пе (Hyung-Chul Pae)¹, Сокьон Кім (Su-Kyong Kim)², Джинюн Пак (Jin-Young Park)¹, Юну Сон (Young Woo Song)¹, Джекук Чха (Jae-Kook Cha)¹, Чонвон Пэк (Jeong-Won Paik)¹, Сонхо Чхве (Seong-Ho Choi)¹ / 

¹ Кафедра парадонтології, дослідницький інститут регенерації тканин парадонту, стоматологічний університет Йонсе (Сеул, Південна Корея) / 
² Імплантологічний дослідницький центр, Osstem Implant (Пусан, Південна Корея) / 

Ціль
Метою цього дослідження є оцінка впливу буферного агенту рН (SOI) на поверхню, що пройшла грубозернисту піскоструйну обробку та травлення кислотою (SLA), з точки зору її змочування, афінності до остеобластів, а також адгезії до поверхні білків крові та тромбоцитів, і їх активації.

Методи
Під час досліджень використовували титанові диски та імплантати із звичайною поверхнею SLA (SA), поверхнею SLA у водному розчині хлориду кальцію (СА) та поверхнею SLA, покритою буферним агентом рН (SOI). Для оцінки швидкості змочування вимірювали число витків різьби, змочених кров'ю за певний проміжок часу. Адсорбцію сироваткового альбуміну перевіряли за допомогою аналізу на біцинхонінову кислоту та за рахунок зміни інтенсивності флуоресценції. В ході дослідження також оцінювали активність остеобластів (включаючи адгезію, поліферацію, диференційовну, міграцію та мінералізацію остеобластів), аналізували адгезію та активацію тромбоцитів.

Результати
Результати тестів на швидкість змочування та адсорбцію сироваткового альбуміну свідчать про значно більшу швидкість змочування поверхні SOI у порівнянні з поверхнею SA (p=0,000 та p=0,000 відповідно). В тестах, які оцінювали адгезію, поліферацію, диференціацію та мінералізацію остеобластів, середній показник були вище в групі SOI у порівнянні з групами SA і CA. Поверхня SOI характеризувалась суттєво більш високою швидкістю міграції остеобластів, адгезії і активації тромбоцитів, ніж поверхня SA (р=0,04, р=0,000 та р=0,000 відповідно).

Висновки
Поверхня SOI характеризується більш вираженою гідрофільністю та афінністю до білків, клітинам і тромбоцитам у порівнянні з поверхнею SA. Результати цього дослідження свідчать про те, що покриття імплантату буфернимагентом рН сприяють адгезії тромбоцитів, білків та клітин до поверхні. Для оцінки ефективності та безпеки поверхні SOI у порівнянні з іншими розповсюдженими поверхнями потребує проведення клінічних досліджень.

Введення
Удосконалення титанових імплантатів дозволило прискорити їх остеоінтеграцію, скоротити терміни протезування та збільшити показники успіхів імплантологічного лікування. Зусилля виробників були в першу чергу направлені на модифікацію поверхні імплантату фізичними та хімічними методами для надання їй гідрофільності та збільшення показників контакту імплантату з кісткою. За данними цілого ряду досліджень, грубозерниста піскоструйна обробка та травлення кислотою дозволяють отримати поверхню (SLA) з мікро- та макротопографією, що сприяє досягненню хороших клінічних результатів.

Крім того, були розроблені хімічні методи модифікації поверхні SLA. Так, для отримання поверхні SLActive (Straumann, Базель, Швейцарія) поверхню SLA занурюють в ізотонічний розчин хлориду натрію для попередження її контамінації вуглецем, що міститься у атмосферному повітрі. За даними досліджень, поверхня SLActive прискорює формування кісткової тканини на різних етапах загоєння. Компанії Osstem вдалося створити хімічно активну поверхню SLA, модифіковану кальцієм (Osstem Implant Co., Ltd., Пусан, Корея), за рахунок занурення імплантату у розчин хлориду кальцію замість хлориду натрію. Результати доклінічного дослідження на кролях показали, що модифікована кальцієм поверхня та поверхня SLActive характеризуються подібними показниками контакту з кісткою.

На властивості імплантату може впливати взаємодія клітин крові з молекулами на поверхні імплантату. Різноманітні білки, включаючи фактори росту та диференціювання, притягаються до гідрофільних поверхонь. У ряді досліджень in vitro оцінювали вплив біохімічних характеристик поверхні імплантату на життєдіяльність, поліферацію, прикріплення та диференціювання клітин: отримані результати свідчать про взаємозв'язок між властивостями поверхні та клітинною активністю.

Формування достатнього за розмірами фібринового згустку забезпечує прямий та стабільний зв'язок між поверхнею імплантату та прилеглою кістковою тканиною, тому він грає важливу роль у тромбогенній відповіді та остеоінтеграції імплантату. Спостереження за згустками фібрину на різних поверхнях виявило взаємозв'язок між характеристиками поверхні та розмірами фібринового згустку.

Формування ложа імплантату призводить до травми тканин, подібній перелому. Розвивається гіпоксія, позаклітинний рН знижується. У кислому середовищі стромальні клітини кісткового мозку характеризуються низькою активністю лужної фосфатази (ЛФ) та низьким синтезом колагену, що грає важливу роль у формуванні кісткової тканини. Отже, було виявлено зниження активності ЛФ з пікового значення при рН практично до нуля при рН менше 7,18. За даними інших досліджень, рівень кислотності впливає на активність ЛФ, синтез колагену, а також гліколіз та синтез ДНК остеобластів. Позаклітинний ацидоз впливає на вхід в клітину іонів кальцію, опосередковано знижуючи агрегацію тромбоцитів.

Під час дослідження оцінювали ефективність хімічно активованої поверхні SLA, покритою буферним розчином рН (SOI). Згідно з результатами досліджень, вона характеризується високою афінністю до білків та тромбоцитів, які в свою чергу сприяють швидкому та стабільному згортанню крові та тромбогенезу. Мета даного дослідження було порівняння ефективності поверхні SLA вкритою буферним розчином рН (SOI), звичайної поверхні SLA та хімічно активованої поверхні SLA, модифікованою кальцієм, в умовах in vitro. Співставляли ряд параметрів, включно адгезію білків крові, афінність до остеобластів, а також адгезію та активацію тромбоцитів.

Матеріали та методи
Підготовка титанових дисків, імплантатів та реагентів
Компанія Osstem Implant надала титанові диски та імплантати з трьома типами поверхні для проведення цього дослідження:
1) Звичайною поверхнею SLA (SA, група негативного контролю);
2) Поверхня SLA у водному розчині хлориду кальцію (СA, група позитивного контролю);
3) Поверхня SLA, покрита буферним агентом рН (SOI, тестова група) (мал. 1а).
Мал. 1. Оцінка змочування поверхні. (А) Кут крайового змочування - кут між краплею рідини та твердою поверхнею. (В) Зміна швидкості змочування. Через 40 секунд поверхня SOI характеризувалась найбільшим числом витків різьби, змочених кров'ю. SA: звичайна поверхня, що пройшла грубозернисту піскоструйну обробку та травлення кислотою, CA поверхня, що пройшла грубозернисту піскоструйну обробку та травлення кислотою у водному розчині хлориду кальцію; SOI: поверхня, що пройшла грубозернисту піскоструйну обробку та травлення кислотою, покрита буферним агентом РН (SOI).

Згідно з даними виробника, ступінь шорсткості (Ra) поверхонь всіх типів складала 2,5 ± 0,5 мкм. Пластикові планшети для культивування клітинних культур закупали у компанії Becton-Dickinson Falcon (Франклін Лейкс, США).
Використовували ембріональну телячу сироватку (ЕТС), рипсин/етилендіамінтетраоцтову кислоту (ЕДТА), пеніцилін та стрептоміцин, середовище Ігла, модифіковане способом Дульбекко (DMEM), виробництва компанії HyClone (Солт-Лейк-Сіті, США), також натрій-фосфатний буферний розчин (PBS) виробництва компанії Invitrogen Corporation (Пейслі, Великобританія). Алізариновий червоний С, тритон X-100, p-нітрофенілфосфат (p-NPP), хлорид магнію й крезиловий фіолетовий придбали у компанії Sigma (Сент - Луіс, США), а 3 - ( 4,5 - диметилтіазол - 2 - або) - 5 - (3 - карбоксіметоксифеніл) - 2 - (4 - сульфофе-ніл)-2H-тетразоліум (MTS) - у компанії Promega (Медисон, США).
Для проведення кожного тесту використовували по три титанових диски з поверхні кожного типу (SA, CA і SOI).

Зміна змочування поверхні (швидкість змочування)
Блюдо діаметром 10 см та глибиною 2-3 см заповнили дефібриновою кров'ю вівці (МВ-S1876; МВ Cell, Сеул, Південна Корея). Апекс імплантатів з поверхнею SA, CA і SOI (4,5 х 13 мм ) занурювали в кров на глибину не більше 2 мм (мал. 1в).
У дослідження включили по 9 імплантатів з кожним типом поверхні. Для оцінки швидкості змочування поверхні підрахували кількість витків різьби, змочених кров'ю за 40 секунд.

Адсорбція сироваткового альбуміну
Тест для вимірювання біцинхонінової кислоти
Очищений бичачий сироватковий альбумін (БСА, 1 мг/мл, 1 мл) наносили на поверхню титанових дисків. Після інкубації при температурі 37°C протягом 1 години неадсорбовану плазму змивали з поверхні дисків. Оброблені БСА диски елюювали протягом 30 хвилин за допомогою лізисного буфера ) 0,2% тритон Х-100 у PBS, pH 7,4) при температурі 37°C. Кондиціоноване середовище оцінювали за допомогою порівняльного тесту на біцинхонінову кислоту (BCA) (BCA Protein Assay Kit № 23227) у відповідності з інструкціями виробника (Pierce, Рокфорд, США). Детекцію білків проводили при довжині хвилі 560 нм за допомогою рідера (DTX 880 Multimode Detector, Beckman Coulter GmbH, Крефельд, Німеччина). Для проведення дослідження використовували по дев'ять титанових дисків з поверхнею кожного типу.

Бичачий-сироватковий альбумін (БСА), мічений ізотіоціанатом флуоресцеіна (ФІТЦ)
Для оцінки адсорбції білку використовували бичачий-сироватковий альбумін, мічений ізотіаоцианатом флуоресцеіна (БСА-ФИТЦ, Sigma), у натрій-фосфатному буферному розчині (PBS)/ Адсорбцію оцінювали за інтенсивністю флуоресценції. Для анаізу адсорбції білка плазми поверхнями SA, CA, SOI на імлантат наносили сироватковий альбумін, кон'югований з ФІТЦ. Після інкубації надлишок сироваткового альбуміну змивали з поверхні імплантатів. Під час дослідження використовували по три імплантати з поверхнею кожного типу. Адсорбцію білку оцінювали за допомогою приладу Typhoon FLA 7000 (GE Healthcare Life Sciences, Чікаго, США) та програмного забезпечення Image J (Національний інститут здоров'я, Бетесда, США) (мал. 2).
Мал. 2. БСА-ФІТЦ на трьох типах поверхні імплантату. Поверхня SOI характеризувалась найбільшою, а поверхня SA - найменшою інтенсивністю флуоресценсії. ФІТЦ: флуоресцеіна ізотіоцианат, БСА; бичачий-сироватковий альбумін; SA: звичайна поверхня, що пройшла грубозернисту піскоструйну обробку й травлення кислотою; СА: поверхня, що пройшла грубозернисту піскоструйну обробку й травлення кислотою, у водному розчині хлориду кальцію; SOI: поверхня, що пройшла грубозернисту піскоструйну обробку й травлення кислотою та покрита буферним агентом рН (SOI).

Аналіз морфології остеобластів
Клітинні культури (культура остеобластів)
Клітинна лінія остеосаркоми людини MG-63 (ФЕСС, Манассас, США) є нетрансформованою клітинною лінією. Клітинну лінію MG-63 культивували у середовищі DMEM з додаванням 10% PBS і 0,1 мг/мл пеніциліну й стрептоміцину. Клітини субкультивували у трипсині/ЕДТА двічі в тиждень; середовище культивування міняли кожні 2 дні.

Растрова електронна мікроскопія (РЕМ)
Для проведення РЕМ клітини MG-63 інкубували на титанових дисках й фіксували 2,5% розчином глутаральдегіду. Після зневоднення на зразки напилювали Pt-Pd для морфологічного дослідження за допомогою растрового електронного мікроскопу (JSM-6480LV, Токіо, Японія) (мал. 3).
Мал. 3. Зображення, отримані за допомогою РЕМ через 30 хвилин після інкубування клітин MG-63 на поверхні кожного типу. Поверхні СА і SOI характеризуються більшою чисельністю остеобластів і більш вираженим диференціюванням клітин, ніж поверхня SA. SA: звичайна поверхня, що пройшла грубозерничту піскоструйну обробку та травлення кислотою; СА: поверхня, що пройшла грубозернисту піскоструйну обробку та травлення кислотою, у водному розчині хлориду кальцію; SOI: поверхня, що пройшла грубозернисту піскоструйну обробку та травлення кислотою, покрита буферним агентом рН (SOI).

Морфологію клітин й розташування остеобластів досліджували за допомогою CLSM. Клітини MG-63 висівали на титанові диски на 24 години й аналізували за допомогою CLSM. Клітини фіксували в 4% формаліні й пермеабілізували в 0,1% тритон Х-100. Потім клітини блокували 7,5% БСА, що містить PBS, протягом 1 години. Для флуоресцентного забарвлення вінкуліну й фібрилярного актину використовували анті-вінкулін Alexa Fluor 488 (Bioscience, Аллентаун, США) и флуоресцентний фаллоідин 555 (Cytoskeleton Inc., Денвер, США) відповідно. Після інкубації протягом 12 годин при температурі 4°C зразки досліджували за допомогою конфокального лазерного скануючого мікроскопу (LSM 700, Carl Zeiss, Oberkochen, Німеччина) (мал.4).
Мал. 4. Зображення, яке отримане за допомогою конфокального лазерного скануючого мікроскопу (імунофлуоресцентне забарвлення клітин) через 30 хвилин після інкубування клітин MG-63 на поверхню кожного типу. Червоний: фарбування фалоідіном; зелений - фарбування вінкуліном. На поверхнях СА і SOI виявили більшу чисельність клітин кістки у порівнянні з поверхнею SA. SA: звичайна поверхня, що пройшла грубозерничту піскоструйну обробку та травлення кислотою; СА: поверхня, що пройшла грубозернисту піскоструйну обробку та травлення кислотою, у водному розчині хлориду кальцію; SOI: поверхня, що пройшла грубозернисту піскоструйну обробку та травлення кислотою, покрита буферним агентом рН (SOI).

Тест для вимірювання лактатдегідрогенази
У розчині тромбоцитів (концентрація 1х108 тромбоцитів/мл в PBS) додавали хлорид кальцію до досягнення його концентрації 2,5 мм і хлори магнію до його кінцевої концентрації 1 мм. Через 30 хвилин суспензію тромбоцитів наносили на титанові диски при температурі 37°C й залишали на 1 годину при температурі 37°C. Було протестовано дев'ять титанових дисків з кожним типом поверхонь. Суспензію тромбоцитів змивали, аби видалити тромбоцити, що не прикріпилися до поверхні. Для кількісної оцінки адгезії тромбоцитів виконували аналіз на лактатдегідрогеназу (ЛДГ). ЛДГ, що вивільняється при лізисі прилиплих до поверхні тромбоцитів, вимірювали за допомогою буфера Triton-PBS і аналізатора CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity assay (Promega). Методи, що використовували в попередніх дослідженнях 31,32 використовували із змінами. Біоактивні характеристики поверхні імплантату, яка покрита буферним агентом рН (SOI): результати дослідження in vitro TS SOI 15.

Тест для вимірювання лактатдегідрогенази
У розчині тромбоцитів (концентрація 1х108 тромбоцитів/мл в PBS) додавали хлорид кальцію до досягнення його концентрації 2,5 мм і хлори магнію до його кінцевої концентрації 1 мм. Через 30 хвилин суспензію тромбоцитів наносили на титанові диски при температурі 37°C й залишали на 1 годину при температурі 37°C. Було протестовано дев'ять титанових дисків з кожним типом поверхонь. Суспензію тромбоцитів змивали, аби видалити тромбоцити, що не прикріпилися до поверхні. Для кількісної оцінки адгезії тромбоцитів виконували аналіз на лактатдегідрогеназу (ЛДГ). ЛДГ, що вивільняється при лізисі прилиплих до поверхні тромбоцитів, вимірювали за допомогою буфера Triton-PBS і аналізатора CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity assay (Promega). Методи, що використовували в попередніх дослідженнях 31,32 використовували із змінами.

Адгезія остеобластів
Аналіз адгезії клітин MG-63 проводили за допомогою набору CellTiter 96® AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay kit (Promega) у відповідності до інструкцій виробника.
Перед проведенням тесту клітини культивували на титанових дисках або 24-луночних пластикових культуральних планшетах (Becton-Dickinson Falcon) при щільності клітин 1×10 протягом 1 години. У дослідження включили по три титанових диска з кожним типом поверхні. Після видалення культурального середовища в кожну лунку додавали по 500 мкл суміші MTS/1-метоксифеназинметосульфат (PMS)/культурне середовище на 2 години. Колориметричний аналіз формазанового фарбника проводили за допомогою аналізатора DTX 880, а оптичну щільність (ОП) вимірювали при довжині хвилі 490 нм.

Поліферація остеобластів
Аналіз поліферації клітин MG-63 проводили за допомогою набору CellTiter 96® AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay kit (Promega) у відповідності до інструкцій виробника. Клітини культивували на титанових дисках або пластикових планшетах. У дослідження включили по три титанових диски з кожним типом поверхні. Після видалення культурального середовища у кожну лунку додавали по 500 мкл суміші MTS/PMS/культуральне середовище на 2 години. Колорометричний аналіз формазанового фарбника проводили за допомогою аналізатора DTX880, а оптичну щільність (ОЩ) вимірювали при довжині хвилі 490 нм.

Диференціювання остеобластів (активність ЩФ)
Для оцінки активності ЩФ клітини MG-63 культивували на титанових дисках або пластикових планшетах у відповідності з описаним раніше протоколом. До дослідження включили по три титанових диски з кожним типом поверхні. Остеогенне середовище (що містить 0,5 мкм дексаметазону, 50 мкг/мл L-аскорбінової кислоти та 10 мкм -гліцерофосфату) міняли кожних 2 дні. Через деякий час клітини промивали й збирали в буфері для лізису. Розчинений білок екстрагували, після чого 100 г білка інкубіювали з р-нітрофеніл фосфатом (р-NPP) з використанням буфера, аби виміряти активність ЩФ в супернатантах ізольованих клітин. Колорометричну реакцію оцінювали за допомогою аналізатора DTX880; оптичну щільність вимірювали при довжині хвилі 405 нм.

Мінералізація остеобластів (фарбування алізариновим червоним С)
Експериментальні зразки зафарбовували алізариновим червоним С, у відповідності з описаним в літературі протоколом, із невеликими змінами. Клітини MG-63 культивували на титанових дисках або пластикових планшетах. У дослідження включили по три титанових диски з кожним типом поверхні. Остеогенне середовище змінювали кожні 2 дні. Через деякий час клітини промивали, а потім фіксували у 10% формальдегіді (Junsei, Токіо, Японія). Клітини зафарбовували 2% алізариновим червоним С при рН 4,2 протягом 20 хвилин. Зафарбовані клітини збирали за стандартною методикою. Рівень абсорбції алізаринового червоного С вимірювався при довжині хвилі 405 нм.

Міграція остеобластів (аналіз хемотаксису: система Transwell®)
Аби оцінити міграцію клітин, клітини MG63 (1х106 клітин/мл) суспедиювали у середовищі 0,1% БСА DMEM. 350 мкл клітинної суспензії поміщали у верхні донорські комірки системи Transwell® (розмір пор 8 мкм, SPL Insert; SPL Life Sciences, Пхочхон, Південна Корея) та інкубували. Нижні "акцепторні" ячейки заповнювали 1 мл елюєнту.
Через 2 години верхні комірки видаляли, а вставку-мембрану Transwell протирали аплікатором з ватним кінчиком. Вставки зафарбовували 0,2% крезиловим фіолетовим, зафарбовані клітини елюірували лимонною кислотою. Колориметричні вимірювання крезилового фіолетового виконували за допомогою аналізатора DTX 880, оптичну щільність вимірювали при довжині хвилі 590 нм. Було протестовано дев'ять титанових дисків з кожним типом поверхні.

Адгезія тромбоцитів
Виділення тромбоцитів (багата на тромбоцити плазма)
Для забору крові новозеландським кролям вагою 2,5-3 кг проводили пункцію серця, використовуючи голки 21G та пробірку з 4% цитратом натрію (Fisher Scientific, Пітсбург, США). Багату на тромбоцити плазму (БаТП) виготовляли за наданою в науковій літературі методикою. БаТП інкубували з хлоридом кальцію (кінцева концентрація, 5 мм) (Fisher Scientific) при температурі 37°C протягом 10 хвилин.

Дослідження фібринової сітки за допомогою РЕМ
Підготовка зразків крові для отримання фібринового згустку
Титанові диски вставляли в 24-коміркові планшети, аби вони щільно торкались стінок комірок, по методу, який описаний Park и Davies. У кожну комірку додавали по 1 мл БаТП і обережно перемішували з білками крові, що утримувались фібриновою сіткою, при температурі 37°С протягом 24 годин.

Підготовка фібринового згустку до дослідження за допомогою РЕМ
Для підготовки до растрової електронної мікроскопії зразки фібринових згустків трохи промивали PBS, після чого фіксували протягом 1 години при кімнтній температурі за допомогою спеціального буфера (2,5% глутаральдегіду, розчиненого у фосфатно-сольовому буфері Дульбекко за допомогою рН 7,0). Після зневоднення злиплої фібринової сітки сумішшю етанолу та води зразки обробляли гексаметилдисілазаном (Sigma) й висушували в критичній точці. Фібринову сітку досліджували за допомогою РЕМ (мал.5).
Мал. 5. Зображення фібринових сіток, отриманих за допомогою РЕМ через 1 годину після фіксації фібринового згустку на поверхні кожного типу. На поверхні SOI виявили численні еритроцити, оточені щільною фібриновою сіткою. SA: звичайна поверхня, що пройшла грубозерничту піскоструйну обробку та травлення кислотою; СА: поверхня, що пройшла грубозернисту піскоструйну обробку та травлення кислотою, у водному розчині хлориду кальцію; SOI: поверхня, що пройшла грубозернисту піскоструйну обробку та травлення кислотою, покрита буферним агентом рН (SOI).

Активація тромбоцитів
Підготовка зразків людських тромбоцитів та їх інкубація на титанових дисках.
БаТП виготовляли за писаним раніше протоколом з крові, отриманої від трьох здорових добровольців. Титанові диски вставляли у 24-коміркові планшети, так, щоб вони щільно торкалися стінок комірок, за методикою Park Davies. Було протестовано по дев'ять титанових дисків з кожним типом поверхні. В кожну лунку додавали по одному мілілітру БаТП. Для стимулювання взаємодії між поверхнями та тромбоцитами, планшети обережно перевертали при температурі 37°С. Супернатант забирали піпеткою через 1 годину для проведення аналізу. Ледь промивали PBS, після чого фіксували протягом 1 години за кімнатної температури за допомогою спеціального буфера (2,5% глутаральдегіду, розчиненого у фосфатно-сольовому буфері Дульбекко при рН 7,0).
Після зневоднення злиплої фібринової сітки сумішшю етанолу та води зразки обробляли гексаметилдисилазаном (Sigma) та висушували у критичній точці. Фібринову сітку досліджували за допомогою РЕМ (мал.5)

Імуноферментний аналіз (ELISA) для вимірювання Р-селектину
У якості критерію активації тромбоцитів вимірювали Р-селектин, глікопротеїн мембрани тромбоцитів, експресований при активації. Проводили імуноферментний аналіз раніше підготовлених супернатантів для вимірювання концентрації розчинного Р-селектину. Всі тести виконувались у відповідності до інструкцій виробника.

Статистичний аналіз
Для проведення статистичного аналізу використовували програмне забезпечення SPSS (версія 23.0; IBM, Армонк, США). Середнє значення швидкості змочування та оптичної щільності та стандартне відхилення розраховували на основі результатів кожного експерименту для трьох типів поверхонб імплантатів (SA, CA та SOI). Для оцінки різниці між трьома поверхнями імплантатів використовували критерій Краскела-Уолліса та Манна-Уітні (непараметричний дисперсійний аналіз). Р-значення < 0,05 вважали статистично значущим. У випадку тестів з n < 4, де проведення статистичного аналізу було неможливе, проводяться тільки середні значення показників та стандартне відхилення.

Результати

Змочування поверхні (вимірювання швидкості змочування)

Імплантати з поверхнею SA, CA та SOI занурювали у кров для вимірювання швидкості змочування (мал. 1В). Середня швидкість змочування поверхонь SA, CA та SOI складала 0,000 витків різьби/сек., 0,069 витків різьби/сек., та 0,124 витків різьби/сек., відповідно (таб.1). Різниця між швидкістю змочування поверхонь SA і СА була статистично значущою (р=0,000). Між групами SA та SOI, CA та SOI також виявили статистично значущу різницю (р=0,000).

Адсорбція сироваткового альбуміну
Тест для вимірювання біцинхонінової кислоти
Сироватковий альбумін наносили на титанові диски з поверхнею SA, CA та SOI. Середній показник адсорбції сироваткового альбуміну поверхнями SA, CA та SOI складає 0,281, 1,120 та 1,287 ОП відповідно (таб.2). Різниця між адсорбцією сироваткового альбуміну поверхнями SA та CA, SA та SOI, CA та SOI була статистично значущою (р=0,000).

БСА, мічений ФІТЦ

Адсорбцію білку оцінювали за інтенсивністю флуоресценції. Інтенсивність складала в середньому 3972, 1599268 пікселів для поверхні SA, CA та SOI відповідно. Дані представлені в таб.2. Статистичний аналіз різниці між групами не проводили через вибірки малого розміру. Тим не менше, між групами спостерігалась суттєва різниця в інтенсивностіфлуоресценції: поверхня SA характеризувалась найнижчими, а поверхня SOI - найвищими показниками.

Морфологія остеобластів
Растрова електронна мікроскопія
Клітини MG-63 інкубували на поверхнях SA, CA та SOI. Кількість остеобластів на поверхнях CA та SOI була вище, ніж на поверхнях SA. Поверхні CA та SOI асоціювались з більш вираженою диференціацією клітин. Число остеобластів на поверхні SOI було трохи вищим, ніж на поверхні СА, але статистично значуща різниця між групами була відсутня (мал.3).

CLSM
Клітини MG-63 інкубували на поверхнях SA, CA та SOI. Виконували імунофлуоресцентне зафарбовування вінкуліну та F-актину, що утворюють цитоскелет клітини. На поверхнях СА та SOI спостерігалось більше кісткових клітин, ніж на поверхні SA (мал.4), що відповідає результатам РЕМ.

Морфологія остеобластів
Растрова електронна мікроскопія
Клітини MG-63 інкубували на поверхнях SA, CA та SOI. Кількість остеобластів на поверхнях CA та SOI було вищим, ніж кількість на поверхні SA. Поверхня CA та SOI асоціювались з більш вираженою диференціацією клітин. Число остеобластів на поверхні SOI було вищим, ніж на поверхні СА, але статистично значуща різниця між групами була
відсутня (мал.3).

Значення приводяться у вигляді середнього значення +/- стандартного відхилення

SA: звичайна поверхня, що пройшла грубозерничту піскоструйну обробку та травлення кислотою; СА: поверхня, що пройшла грубозернисту піскоструйну обробку та травлення кислотою, у водному розчині хлориду кальцію; SOI: поверхня, що пройшла грубозернисту піскоструйну обробку та травлення кислотою, покрита буферним агентом рН (SOI). a) У порівнянні з групою SA різниця у показниках була статистично важливою.

Значення приводяться у вигляді середнього значення +/- стандартного відхилення

SA: звичайна поверхня, що пройшла грубозерничту піскоструйну обробку та травлення кислотою; СА: поверхня, що пройшла грубозернисту піскоструйну обробку та травлення кислотою, у водному розчині хлориду кальцію; SOI: поверхня, що пройшла грубозернисту піскоструйну обробку та травлення кислотою, покрита буферним агентом рН (SOI). ОЩ: оптична щільність; ФІТЦ: флуоресцеїна ізотіоцинат; БСА: бичаче-сироватковий альбумін. а) У порівнянні з групою SA різниця у показниках була статистично важливою.

CLSM
Клітини MG-63 інкубували на поверхнях SA, CA, SOI. Виконували імунофлуоресцентне забарвлення вінкуліну та F-актина, що утворюють цитоскелет клітини. На поверхнях CA та TS SOI спостерігалось більше кісткових клітин, ніж на поверхні SA (мал.4), що відповідає результатам РЕМ.

Адгезія остеобластів
Середня ОЩ у тесті на адгезію клітин склала 0,438, 0,842 і 0,949 для поверхонь SA, CA, SOI відповідно. Дані представлені в таб.3. Статистичний аналіз різниці між групами не проводили через маленькі вибірки, але поверхня SA характеризувалась найменше вираженою адгезією клітин.

Проліферація остеобластів
Середня ОП у тесті на проліферацію остеобластів становила 0,701, 0,837 та 0,912 для поверхонь SA, CA та SOI відповідно. Дані представлені у табл. 3. Статистичний аналіз відмінностей між групами не проводили через малий розмір вибірки, проте поверхня SA характеризувалася найменшими, а поверхня TS SOI – найбільшими показниками. Водночас різниця між групами не була суттєвою.

Поліферація остеобластів
Середня ОЩ в тесті на полферацію остеобластів складала 0,701, 0837 і 0,912 для поверхонь SA, CA і SOI відповідно. Дані представлені в таб.3. Статистичний аналіз різниці між групами не проводили через маленбкі вибірки, але поверхня SA характеризувалась найменшими, а поверхня SOI - найбільшими показниками. У той же час різниця між групами не була суттєвою.

Мінералізація остеобластів
Середні показники мінералізації остеобластів складали 320,4, 382,6 і 452,1 нМ для поверхонь SA, CA і SOI відповідно. Дані представлені в таб.3. Статистичний аналіз різниці між групами не проводили через маленькі вибірки, але поверхня SA характеризувалась найменшим значенням.

Значення надаються у вигляді середнього значення +/- стандартне відхилення

SA: звичайна поверхня, що пройшла грубозерничту піскоструйну обробку та травлення кислотою; СА: поверхня, що пройшла грубозернисту піскоструйну обробку та травлення кислотою, у водному розчині хлориду кальцію; SOI: поверхня, що пройшла грубозернисту піскоструйну обробку та травлення кислотою, покрита буферним агентом рН (SOI). ОЩ: оптична щільність. a) У порівнянні з групою SA різниця у показниках була статистично важливою; b) У порівнянні з групою СА різниця у показниках була статистично важливою.

Міграція остеобластів
Згідно з результатами імуноферментного аналізу (ELISA) середнє значення оптичної щільності вмісту розчинного Р-селектину на поверхнях склали 0,195, 0,195 та 0,215 відповідно (таб. 3). Статистично значуща різниця між групами SA і CA була відсутня (p=0,931). Тим часом поверхня SOI характеризувалась значно біль вираженою міграцією остеобластів: різниця між групою SOI і групами SA, CA була статистично значущою (p=0,040 і p=0,031 відповідно.

Адгезія тромбоцитів
Середнє значення оптичної щільності вмісту лактатдегідрогенази, що є маркером адгезії тромбоцитів, складали 0,185, 0,225 і 0,298 для поверхонь SA, CA і SOI відповідно (таб.4). Різниця між групами SA, CA і SOI відповідно (таб.4). Різниця між групами SA і CA була статистично значущою (p=0,000). Поверхня SOI характеризувалась найбільш вираженою адгезією тромбоцитів: різниця між групою SOI і групами SA і CA була статистично значущою (p=0,000 і p=0,040 відповідно).

Дослідження фібринової сітки за допомогою РЕС
Морфологію фібринової сітки на кожній поверхні досліджували за допомогою РЕС. На поверхні SA спостерігалась найменша кількість ерітроцитів; фібринова сітка практично була відсутня. Поверхні CA і SOI характеризувались високою чисельністю еритроцитів, що оточені щільною фібриновою сіткою. Чисельність еритроцитів була максимальною на поверхні SOI (мал.5).

Активація тромбоцитів
Згідно з результатами імуноферментного аналізу (ELISA) середнє значення оптичної щільності вмісту розчинного Р-селектину на поверхнях SA, CA і SOI склали 0,112, 0,251 і 0,414 відповідно (таб.4). Різниця між групами SA і CA, SA і SOI, а також CA і SOI була статистично значущою (p=0,000).

Обговорення

У раніше приведених дослідженнях, порівнювали звичайну поверхню SLA і поверхню SLA, що покрита буферним агентом рН (SOI), з точки зору їх гідрофільності і аффінності до білків, клітинам і тромбоцитам. Результати досліджень in vitro свідчать про перевагу поверхні SOI.
Змочування поверхні визначається крайовим кутом змочування, що утрорюється між краплею рідини і поверхнею плоского диску. Кути крайового змочування поверхонь CA і SOI наближались до нуля, що утруднювало порівняння поверхонь, тому для оцінки швидкості змочування рахували число витків різьби, змочених кров'ю. Швидкість змочування не дозволяє точно оцінити гідрофільність або змочуваність поверхні. Але , автори дослідження вирішили виміряти саме цей параметр, оскільки здатність імплантату "приваблювати" кров має важливе клінічне значення. Бидві поверхні мають яскраво виражений гідрофільність, яка є методологічним обмеженням цього досліда. Швидкість змочування поверхонь CA і SOI була суттєво вищою у порівнянні з поверхнею SA.

Швидкість змочування поверхі SA була близькою до нуля. На відміну від двох інших поверхонь, поверхня SA була попередньо сухою, що частково пояснює її гідрофобність. Таким чином, результат, який зареєстровано в групі SOI, зумовлюється не тільки дією буферного агента (SOI). Для імітації реальної клінічної ситуації, раціонально використовувати суху поверхню SLA, а не занурювати її в ізотонічний соляний розчин. У раніше проведеному дослідженні, яке направлене на порівняння поверхонь SLActive і SLA, поверхня SLActive була попередньо занурена в ізотонічний розчин NaCl, а поверхня SLA була суха (контрольна група).

Оптимальний ступінь гідрофільності поверхні імплантату залишається не зрозумілою. На цей день відсутні докази біологічної та клінічної переваги супергідрофільної поверхні імплантату. Того ж часу, згідно з результатами експериментів на тваринах та клінічних дослідженнях, поверхня з вираженими гідрофільними властивостями покращує остеоінтеграцію за рахунок більш високого контакту імплантату з кісткою. Було установлено, що змочування поверхні впливає на клітинні взаємодії, адгезію білків та інших молекул до поверхні імплантату. Це корелюється з даними цього дослідження, де поверхня SOI з найбільш високою швидкістю змочування характеризувалась яскраво вираженою афінністю до білків і остеобластів.

У ряді досліджень in vitro оцінювали біохімічні властивості поверхоні імплантатів, включно життєздатність клітин, їх поліферацію, адгезію й диференціювання. Soares й співавтори порівняли біологічну ефективність поверхонь імплантатів, що пройшли різну обробку. Під час дослідження враховували ряд параметрів: життєздатність клітин (мітохондриальну активність), прикріплення клітин до поверхні, загальний білок у сироватці крові й ЩФ. Було встановлено, що характеристики поверхонь імплантату впливають на клітинну відповідь у прилеглих до імлантату тканинах, а також ступінь адсорбції білків.

Martin й співавтори досліджували поліферацію клітин, синтез ДНК, активність ЩФ, синтез РНК, білків і протеогліканів при культивуванні остеобластоподібних клітин MG-63 на 5 типах поверхонь імплантатів. Вони також оцінювали морфологію й розподіл клітин, культивованих на поверхні кожного типу. Martin й співавтори прийшли до висновку, що шорсткуватість поверхні впливає на поліферацію й диференцировку
остеобластів й виробку ними кісткового матриксу.

Eriksson й співавтори проаналізували вплив поверхневої енергії імплантату на життєдіяльність клітин, активність ЩФ, продукування фактору росту ендотелію судин, наявність остеокальцину й клітин, чутливих до кісткового морфогенетичного білку-2. Поверхнева енергія мала важливу роль на ранніх етапах загоєння. Eriksson й співавтори продемонстрували, що висока поверхнева енергія сприяє диференціації та активації клітин.

Автори цього дослідження оцінювали адгезію та поліферацію клітин MG-63 під час колориметричного тесту з використанням фарбника формазану. Зображення, отримані за допомогою растрового електронного мікроскопу, підтверджують більш активну поліферацію та диференцірування клітин на поверхні SOI у порівнянні з іншими поверхнями.

ЩФ активно експресується під час поліферації остеобластів, тому її концентрація дозволяє оцінити деференцірування остеобластів. Відкладення кальцію в клітинних культурах зафарбовували алізариновим червоним для оцінки рівня мінералізації позаклітинного матриксу.

Для аналізу міграції остебластів використовували систему Transwell®, що вимірює рух кллітин по градієнту концентрації хемоаттарктанту. Число тестів на адгезію, поліферацію, диференціацію клітин і мінералізацію остеобластів було недостатнім для виявлення статистично значущою різниці між групами, тим не менш, згідно отриманим даним, поверхня SA була найменш, а поверхня SOI - найбільш сприятливою для прикріплення остеобластів.

Di orio та співавтори досліджували фібринові згустки на поверхні імплантатів. Чорні точки на зображеннях, отриманих за допомогою растрогового електронного мікроскопу, вважали за індикатор наявності фібринового згустку. Число точок автоматично підраховували за допомогою спеціального програмного забезпечення. Під час цього дослідження рівень адгезії тромбоцитів оцінювали за допомогою вимірювання лактатдегідрогенази, яка вивільнюється при лізисі прикріплених до поверхні тромбоцитів. Для визначення ступеню активації тромбоцитів вимірювали Р-селектин, глікопротеїн мембрани тромбоцитів, який експресуєтьсяпри активації тромбоцитів. В тесті на адгезію тромбоцитів поверхня SOI характеризувалась найбільш високим середнім показником, але статистично достовірна різниця між групами SOI і CA була відсутня. В тесті на активацію тромбоцитів поверхня SOI асоціювалась з найбільш вираженою активацією тромбоцитів: різниця між групами була статистично важливою. РЕМ підтвердила формування мережі еритроцитів фібрину на поверхні SOI.

Активність остеобластів сягає максимуму при рН 7,4, що відповідає слабкій основі, й практично щезає рН нижче 6,9. Автори даного дослідження використовували для культивування клітин MG-63 слабо лужне середовище з рівнем рН, відповідним крові. Не дивлячись на регулярну заміну розчину для культивування клітин, неможливо було підтримувати його рН, оскільки на нього впливали метаболіти клітин. Крім того, рН середовища міг змінитися через помилки лаборантів. Якщо хід досліджень виключає травму кістки, що призводить до зниження рівня рН, буферний агент рН сприяє підтриманню постійного рН навіть в умовах in vitro. Можна передбачити, що буферний агент рН створює сприятливі умови для активності остеобластів за рахунок підтримки постійного рН й попередження його помітних коливань. Результати цього дослідження свідчать про підвищену активність остеобластів у групі SOI. Іони кальцію пов'язуються з різними білками у розчині і виступають у ролі буфера, підтримуючи слаболужний рівень рН. Варто враховувати, що іони кальцію беруть участь в остеогенних процесах. Важливо відмітити, що поверхня СА має буферний ефект, хоч й менше виражений, ніж поверхня SOI. Поверхні СА і SOI характеризувались значно більшим показником адгезії та активації тромбоцитів, ніж поверхня SA. Активність тромбоцитів інгібується позаклітинним ацидозом й стимулюється позаклітинним алкалозом. Оскільки на активність тромбоцитів впливає позаклітинний рН, можна передбачити, що їх активація на поверхнях CA і SOI була обумовлена буферними властивостями поверхонь.

Дані наукової літератури різноманітні: у ряді експериментів вдалося виявити значні відмінності між поверхнями CA і SOI, в інших дослідженнях різниця між ними була відсутня. Оскільки поверхні CA і SOI володіють буферним ефектом у ізотонічному розчині, результати експериментів не відрізнялись один від одного, якщо поверхня не впливала на клітинну активність. Поверхня SA не була занурена у розчин і не мала буферних властивостей, що пояснюється більш низькими показниками у більшості експериментів.

Поверхня SLA, покрита буферним агентом рН, характеризується більш вираженою гідрофільністю та аффінністю до протеїнів, клітин та тромбоцитів, ніж звичайна поверхня SLA.

Отримані дані варто інтерпретувати з обережністю, оскільки число проведених тестів не було стандартним й в деяких випадках їх було недостатньо для виявлення статистично значимої різниці між групами. Буферний ефект поверхні сприяє підвищенню рівня ЩФ, сприяє тромбогенезу й стимулює активність остеобластів після препрування ложа імплантату, спровокувашого зменшення рівня рН. Враховуючи обмеження цього дослідження, його результати дозволяють зробити висновок, що нова поверхня SOI більш ефективно стимулює прикріплення до неї тромбоцитів, кісткоутворюючих білків й клітин у порівнянні із звичайною поверхнею SLA, що в свою чергу прискорює остеоінтеграцію імплантату. Для оцінки ефективності й безпеки поверхні SLA, що вкрита агентом рН, у порівнянні з іншими розповсюдженими типами поверхні потребує проведення клінічних досліджень.

Подяки
Автори виражають подяку компанії Osstem Implant за технічну підтримку, надану при проведенні цього дослідження.